I1PP2A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402988-ACT

ANP32A codifica I1PP2A, una fosfoproteina nucleare acida ricca di leucina che funge da inibitore della protein fosfatasi 2A (PP2A), modulando la segnalazione dipendente dalla fosforilazione e i processi associati alla cromatina. Attraverso la modulazione dell’attività di PP2A, I1PP2A influenza la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno del DNA, i programmi trascrizionali e le reti di segnalazione adattative allo stress. ANP32A è stata collegata alla regolazione dell’apoptosi e delle risposte immunitarie innate ed è spesso studiata in contesti in cui un controllo aberrante delle fosfatasi altera l’omeostasi cellulare. Un’espressione o una funzione deregolate di ANP32A/I1PP2A sono state associate alla biologia tumorale, a meccanismi neurodegenerativi e alla segnalazione infiammatoria, a supporto della sua rilevanza in modelli di malattia incentrati sulle vie di segnalazione.

ANP32A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ANP32A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ANP32A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ANP32A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ANP32A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ANP32A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ANP32A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ANP32A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ANP32A nelle cellule tumorali con espressione di ANP32A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.