HXK III Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403846-ACT

L’HK3 umano codifica l’esochinasi III (HXK III), un enzima che fosforila il glucosio e catalizza la conversione del glucosio in glucosio-6-fosfato in modo dipendente dall’ATP, impegnando i substrati esosi nel metabolismo intracellulare. Generando glucosio-6-fosfato, HXK III contribuisce a regolare il flusso glicolitico e favorisce la deviazione verso la via dei pentoso fosfati per la produzione di NADPH e il mantenimento dell’omeostasi redox. L’espressione di HK3 è spesso studiata in contesti immunitari ed ematopoietici, in cui la riprogrammazione metabolica influenza la segnalazione infiammatoria, la differenziazione e le risposte allo stress. Un’attività esochinasica deregolata e alterazioni della trascrizione di HK3 sono state associate a fenotipi metabolici rilevanti per la malattia, inclusi un utilizzo anomalo del glucosio e l’attivazione di vie legate allo stress ossidativo.

HXK III Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HK3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HXK III Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HK3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HK3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HXK III. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HK3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HXK III nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HXK III nelle cellule tumorali con espressione di HK3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.