HXK II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400611-ACT

HK2 umano codifica l’esochinasi II (HXK II), un enzima associato ai mitocondri che catalizza la fosforilazione del glucosio, dipendente da ATP, a glucosio-6-fosfato, impegnando il glucosio nella glicolisi e nelle vie biosintetiche correlate. Accoppiando il flusso glicolitico al metabolismo mitocondriale, HXK II influenza l’omeostasi energetica cellulare, l’equilibrio redox e la disponibilità di precursori anabolici che alimentano la via dei pentoso fosfati e la sintesi di nucleotidi e lipidi. Un’elevata espressione di HK2 e una glicolisi rimodellata si osservano spesso in stati proliferativi e adattati allo stress, collegando HXK II alla riprogrammazione metabolica nella biologia dei tumori, nell’attivazione delle cellule immunitarie e nella segnalazione responsiva all’ipossia. Alterazioni dell’attività di HK2 sono state inoltre implicate nei tessuti insulino-responsivi e nei meccanismi delle malattie metaboliche, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per studiare l’utilizzo del glucosio e il crosstalk tra mitocondri e metabolismo.

HXK II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HK2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HXK II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HK2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HK2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HXK II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HK2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HXK II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HXK II nelle cellule tumorali con espressione di HK2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.