HuR/ELAV1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421003-ACT

Elavl1 codifica HuR/ELAV1, una proteina legante l’RNA che riconosce elementi ricchi in AU nelle 3′ UTR e modula la stabilità, la localizzazione e la traduzione dell’mRNA. Nelle cellule murine, HuR coordina programmi di regolazione genica post-trascrizionale legati al controllo del ciclo cellulare, alle risposte allo stress, alla segnalazione immunitaria innata e alla differenziazione, plasmando l’emivita di trascritti di citochine, fattori di crescita e geni associati alla sopravvivenza. L’attività di HuR è regolata dinamicamente tramite fosforilazione e shuttling nucleo-citoplasmatico, integrando input di segnalazione MAPK, PKC e di altre vie per affinare i livelli di espressione genica. In letteratura, regoloni RNA dipendenti da HuR deregolati sono stati associati a infiammazione, trasformazione oncogenica e rimodellamento tissutale, rendendo Elavl1 un nodo utile per studi meccanicistici sul metabolismo dell’RNA e sul crosstalk tra vie di segnalazione.

HuR/ELAV1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Elavl1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HuR/ELAV1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Elavl1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Elavl1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HuR/ELAV1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Elavl1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HuR/ELAV1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HuR/ELAV1 nelle cellule tumorali con espressione di Elavl1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.