Hugl-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403441-ACT

LLGL1 codifica a proteína humana Hugl-1, um regulador conservado da polaridade de células epiteliais e da organização da membrana basolateral. A Hugl-1 atua em redes de polaridade ápico-basal que coordenam a integridade das junções, a divisão celular assimétrica e a organização do citoesqueleto, influenciando assim a arquitetura e a diferenciação dos tecidos. A perturbação do controle de polaridade está associada a migração alterada e comportamento invasivo, tornando o LLGL1 um nó relevante para estudos de homeostase epitelial, morfogênese e perda de polaridade associada a tumores. A expressão e a localização de LLGL1 também são usadas para investigar a comunicação cruzada entre módulos de polaridade e vias que regulam a proliferação e a adesão célula–célula.

Hugl-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de LLGL1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Hugl-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus LLGL1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição LLGL1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Hugl-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus LLGL1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Hugl-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Hugl-1 em células tumorais com expressão de LLGL1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.