HSPA8/HSC70 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418508-ACT

HSPA8 codifica la proteina heat shock cognate da 71 kDa (HSC70), uno chaperone della famiglia HSP70 espresso in modo costitutivo che sostiene la proteostasi mediando il ripiegamento, il rirotiegamento e il traffico delle proteine client in modo ATP-dipendente. HSC70 partecipa all’endocitosi mediata da clatrina, all’autofagia mediata da chaperone tramite riconoscimento di LAMP2A e alle vie di controllo qualità proteico collegate al sistema ubiquitina–proteasoma e alla dinamica dei granuli di stress. Attraverso la regolazione della gestione dei polipeptidi nascenti, dell’importazione proteica negli organelli e delle reti chaperone–cochaperone, HSPA8 influenza la sopravvivenza cellulare in condizioni di stress proteotossico e metabolico. La disregolazione della proteostasi centrata su HSC70 è implicata nella neurodegenerazione, nell’adattamento allo stress delle cellule tumorali e nella biologia delle infezioni virali, rendendo HSPA8 un nodo utile per studi meccanicistici delle vie di stress e di traffico intracellulare.

HSPA8/HSC70 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HSPA8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSPA8/HSC70 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HSPA8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HSPA8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSPA8/HSC70. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HSPA8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSPA8/HSC70 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSPA8/HSC70 nelle cellule tumorali con espressione di HSPA8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.