HSP 90α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400088-ACT

HSP90AA1 codifica per la proteina umana da shock termico HSP90α (HSP 90α), un abbondante chaperone molecolare ATP-dipendente che stabilizza e ripiega un’ampia gamma di proteine “client”, incluse chinasi, recettori degli ormoni steroidei e fattori di trascrizione. HSP90α sostiene la proteostasi e l’adattamento cellulare allo stress coordinandosi con co-chaperoni, regolando la maturazione proteica e tamponando le proteine mal ripiegate durante lo shock termico e altri stress. Attraverso la sua rete di client, HSP90α interagisce con vie di segnalazione come MAPK e PI3K–AKT, oltre che con i processi di controllo del ciclo cellulare e di risposta al danno al DNA. Un’espressione o una dipendenza deregolata di HSP90AA1 è spesso studiata in contesti quali il rimodellamento della segnalazione nelle cellule tumorali, l’aggregazione proteica nelle neurodegenerazioni e le risposte infiammatorie allo stress, rendendolo un nodo centrale per la ricerca meccanicistica delle vie di segnalazione.

HSP 90α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HSP90AA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSP 90α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HSP90AA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HSP90AA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSP 90α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HSP90AA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSP 90α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSP 90α nelle cellule tumorali con espressione di HSP90AA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.