HoxA2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403732-ACT

HOXA2 codifica per il fattore di trascrizione homeobox umano HoxA2, un regolatore che si lega al DNA in modo specifico per sequenza e che definisce l’identità antero-posteriore durante l’embriogenesi e coordina la specificazione di linea in tessuti derivati dalla cresta neurale e associati al rombencefalo. HoxA2 influenza i programmi trascrizionali dello sviluppo modulando lo stato della cromatina e integrandosi con le reti regolatorie responsivi all’acido retinoico e con quelle del cluster HOX che controllano le decisioni di destino cellulare e la morfogenesi dei tessuti. Un’espressione deregolata di HOXA2 è stata associata ad anomalie craniofacciali congenite e a disturbi del neurosviluppo, e un’alterata attività dei programmi HOX è studiata anche nel contesto della riprogrammazione trascrizionale oncogenica. In quanto regolatore dello sviluppo con effetti dipendenti dal contesto, HOXA2 rappresenta un nodo utile per analizzare le traiettorie di differenziamento e l’architettura dei circuiti trascrizionali.

HoxA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HOXA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HoxA2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HOXA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HOXA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HoxA2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HOXA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HoxA2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HoxA2 nelle cellule tumorali con espressione di HOXA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.