HNF-3γ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401720-ACT

FOXA3 codifica per il fattore nucleare degli epatociti 3 gamma (HNF-3γ), un fattore di trascrizione della famiglia forkhead box che contribuisce a stabilire e mantenere i programmi di lineage endodermico e regola geni coinvolti nella differenziazione epiteliale e nell’omeostasi metabolica. HNF-3γ partecipa a reti trascrizionali che coordinano l’accessibilità della cromatina e l’attività di promotori/enhancer, intersecandosi con vie che controllano il metabolismo del glucosio e dei lipidi, la funzione epatica e lo sviluppo gastrointestinale. Nelle cellule umane, l’attività di FOXA3 contribuisce alle decisioni di identità cellulare e al rimodellamento, dipendente dal contesto, dei circuiti di regolazione genica. Un’espressione deregolata di FOXA3/HNF-3γ o dei programmi trascrizionali a valle è stata associata a stati di differenziazione alterati e a fenotipi rilevanti per la malattia nella biologia epatica e gastrointestinale, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici.

HNF-3γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FOXA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HNF-3γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FOXA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FOXA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HNF-3γ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FOXA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HNF-3γ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HNF-3γ nelle cellule tumorali con espressione di FOXA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.