HNF-3β Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400210-ACT

FOXA2 codifica il fattore nucleare degli epatociti 3-beta (HNF-3β), un fattore di trascrizione “winged-helix” che agisce come regolatore pioniere dell’accessibilità della cromatina e dell’espressione genica specifica di linea cellulare. Coordina programmi di sviluppo e funzioni omeostatiche nei tessuti derivati dall’endoderma, tra cui fegato, pancreas e polmone, controllando reti coinvolte nella differenziazione epiteliale, nel metabolismo di glucosio e lipidi e nell’identità delle cellule secretorie. FOXA2 interagisce con vie di segnalazione come Wnt/β-catenina, TGF-β e Notch per modulare stati trascrizionali e plasticità cellulare. Un’attività deregolata di FOXA2 è stata associata ad alterazioni della regolazione metabolica e a programmi di differenziazione aberranti osservati in diversi contesti rilevanti per la malattia, inclusi la biologia dei tumori e la disfunzione endocrina.

HNF-3β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FOXA2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HNF-3β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FOXA2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FOXA2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HNF-3β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FOXA2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HNF-3β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HNF-3β nelle cellule tumorali con espressione di FOXA2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.