HLA-E Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-437133-ACT

H2-T-ps codifica una molecola murina del complesso MHC di classe Ib, funzionalmente analoga a HLA-E, specializzata nella presentazione di un repertorio peptidico ristretto per regolare la sorveglianza immunitaria innata e adattativa. Interagendo con i recettori CD94/NKG2 sulle cellule NK e su sottopopolazioni di cellule T, le molecole di tipo HLA-E contribuiscono a modulare le soglie di attivazione citotossica, collegando l’elaborazione dell’antigene nel reticolo endoplasmatico con una segnalazione simile a quella dei checkpoint immunitari. Questo asse si integra con vie guidate dagli interferoni che modulano la presentazione dell’antigene e le risposte cellulari allo stress, influenzando l’omeostasi tissutale durante l’infiammazione. Un’espressione o un caricamento peptidico deregolati dell’MHC I non classico possono alterare l’educazione delle cellule NK e le interazioni tra tumore e sistema immunitario, rendendo questo gene rilevante per studi su infezioni, autoimmunità e immunobiologia del cancro in modelli murini.

HLA-E Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di H2-T-ps senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HLA-E Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus H2-T-ps nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione H2-T-ps, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HLA-E. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus H2-T-ps nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HLA-E nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HLA-E nelle cellule tumorali con espressione di H2-T-ps silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.