HIRA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404262-ACT

HIRA umano codifica uno chaperone degli istoni che, in collaborazione con ASF1A/ASF1B, deposita la variante istonica H3.3 in modo indipendente dalla replicazione del DNA, modellando l’accessibilità della cromatina e stati trascrizionali di lungo periodo. L’incorporazione di H3.3 dipendente da HIRA sostiene la stabilità del genoma, le risposte allo stress replicativo, il rimodellamento della cromatina associato alla senescenza e la corretta regolazione dei programmi genici dello sviluppo e del ciclo cellulare. Influenzando l’assemblaggio dei nucleosomi a livello di promotori, enhancer e siti di danno al DNA, HIRA collega il mantenimento epigenetico alle vie che controllano differenziamento, proliferazione e invecchiamento cellulare. Una funzione o un’espressione deregolata di HIRA è stata associata a un’organizzazione anomala della cromatina e a programmi trascrizionali aberranti osservati in ambito oncologico e neuro-sviluppativo, rendendola un nodo utile per studi di epigenetica meccanicistica.

HIRA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HIRA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HIRA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HIRA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HIRA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HIRA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HIRA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HIRA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HIRA nelle cellule tumorali con espressione di HIRA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.