hippocalcin Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-420938-LAC

Il gene Hpca del topo codifica l’ippocalcina, una proteina legante il Ca2+ con dominio EF-hand arricchita nei neuroni, appartenente alla famiglia dei sensori neuronali del calcio, che collega i transitori intracellulari di calcio alla segnalazione a valle. L’ippocalcina partecipa a processi dipendenti dall’attività sinaptica, inclusa la modulazione dell’eccitabilità di membrana, l’omeostasi del calcio e il traffico vescicolare, ed è stata associata a vie che plasmano la plasticità sinaptica a lungo termine nei circuiti dell’ippocampo. Attraverso un comportamento tipo “calcium-myristoyl switch” e interazioni con partner della segnalazione neuronale, può influenzare risposte regolate dal Ca2+ quali la segnalazione del cAMP, la dinamica dei recettori e programmi di espressione genica dipendenti dall’attività. La disregolazione della segnalazione associata all’ippocalcina è stata studiata nel contesto delle risposte neuronali allo stress e di fenotipi rilevanti per la neurodegenerazione, supportandone l’uso come punto d’ingresso molecolare per indagare i meccanismi alla base della disfunzione cognitiva e sinaptica.

Le particelle di attivazione lentivirale hippocalcin (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Hpca in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale hippocalcin (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Hpca, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di hippocalcin. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Hpca e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.