HIP12 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405552-ACT

Humanes HIP1R kodiert das Huntingtin-interagierende Protein 1 Related (HIP12), einen endozytotischen Adapter, der clathrinbeschichtete Einstülpungen (clathrin-coated pits) mit dem Aktinzytoskelett verbindet und an der Rezeptor-Internalisierung sowie am Membrantransport beteiligt ist. HIP12 enthält Domänen, die an Clathrin und F‑Aktin binden, und unterstützt damit die Vesikelbildung, die Sortierung von Fracht sowie die Koordination der Zytoskelettdynamik. Über diese Funktionen trägt HIP12 zu Signalwegen bei, die Endozytose, die Abschwächung der Zellsignalübertragung und zytoskelettabhängige Umbauvorgänge steuern. Eine veränderte Regulation endozytotischer Adapter wie HIP1R wurde in der Literatur mit Störungen von Signalnetzwerken und der zellulären Homöostase in Verbindung gebracht, die für die Neurobiologie und krebsassoziierte Phänotypen relevant sind, wodurch HIP12 ein nützliches Ziel für mechanistische Studien darstellt.

HIP12 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HIP1R-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HIP12 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HIP1R-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HIP1R-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HIP12-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HIP1R-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HIP12-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HIP12-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HIP1R-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.