HES5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401625-ACT

HES5 codifica un repressore trascrizionale di tipo basic helix–loop–helix che agisce come effettore canonico della segnalazione Notch. Legandosi a motivi simili alle E-box e reclutando complessi corepressori, HES5 sopprime i programmi pro-differenziamento per mantenere l’identità dei progenitori neurali e regolare la tempistica della neurogenesi. La sua attività si integra con vie che controllano le decisioni di destino cellulare, incluse interazioni (crosstalk) con la segnalazione Wnt/β-catenina, BMP e SHH durante lo sviluppo. Un’espressione deregolata di HES5 è stata associata a stati di differenziamento aberranti e a una capacità proliferativa alterata in contesti in cui l’attività della via Notch contribuisce alla biologia della malattia.

HES5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HES5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HES5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HES5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HES5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HES5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HES5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HES5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HES5 nelle cellule tumorali con espressione di HES5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.