Herc5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404993-ACT

Il gene umano HERC5 codifica Herc5, una ligasi E3 stimolata dall’interferone che catalizza la coniugazione di ISG15 (ISGilazione) alle proteine di nuova sintesi, modulando la segnalazione dell’immunità innata e la restrizione antivirale. Herc5 opera all’interno della via di modificazione ISG15/ubiquitina-like, coordinandosi con gli enzimi E1/E2 per regolare stabilità, localizzazione e reti di interazione delle proteine durante le risposte all’interferone di tipo I. Attraverso il controllo della proteostasi guidata dall’interferone e di programmi sensibili allo stress, HERC5 influenza vie collegate al riconoscimento dei patogeni e alla segnalazione infiammatoria. Un’ISGilazione deregolata e firme di interferone sono state associate a patologie immunomediate e a interazioni tra tumore e sistema immunitario, rendendo HERC5 un bersaglio rilevante per studi meccanicistici in immunologia e biologia del cancro.

Herc5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HERC5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Herc5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HERC5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HERC5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Herc5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HERC5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Herc5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Herc5 nelle cellule tumorali con espressione di HERC5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.