HAI-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423128-ACT

Il gene murino **Spint1** codifica l’inibitore dell’attivatore del fattore di crescita degli epatociti-1 (**HAI-1**), un inibitore transmembrana delle serin-proteasi di tipo Kunitz che limita la proteolisi pericellulare inibendo **matriptasi/ST14** e proteasi correlate. Riducendo il processamento di substrati guidato dalle proteasi, come il **pro-HGF** e altre proteine extracellulari, HAI-1 contribuisce a coordinare l’integrità della barriera epiteliale, l’adesione cellula-cellula e un rimodellamento regolato della matrice extracellulare. L’attività di Spint1 interseca vie di segnalazione attivate da proteasi e vie dei fattori di crescita che influenzano l’omeostasi epiteliale, l’infiammazione e la riparazione tissutale. Uno squilibrio nella regolazione HAI-1/proteasi è associato a fenotipi di rimodellamento epiteliale e a processi di invasione legati ai tumori, rendendo Spint1 un nodo utile per studi meccanicistici in biologia del cancro e nella biologia dello sviluppo degli epiteli.

HAI-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Spint1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HAI-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Spint1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Spint1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HAI-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Spint1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HAI-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HAI-1 nelle cellule tumorali con espressione di Spint1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.