HAI-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404011-ACT

SPINT1 codifica l’inibitore-1 dell’attivatore del fattore di crescita degli epatociti (HAI-1), un inibitore delle serin-proteasi di tipo Kunitz associato alla membrana, che limita la proteolisi pericellulare inibendo proteasi come HGFA e matriptasi (ST14). Regolando l’attivazione di HGF e la segnalazione a valle attraverso la via MET, HAI-1 influenza l’omeostasi epiteliale, l’integrità delle giunzioni cellula-cellula e il rimodellamento della matrice extracellulare. Le reti SPINT1–proteasi si intersecano con processi che includono la differenziazione epiteliale, la riparazione delle ferite e le cascate infiammatorie di proteasi. Un’espressione deregolata di HAI-1 o uno squilibrio rispetto alle proteasi corrispondenti è stato associato ad alterazioni della funzione di barriera epiteliale e a fenotipi guidati dalle proteasi riportati in molteplici contesti di ricerca su tumori e malattie fibrotiche.

HAI-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPINT1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HAI-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPINT1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPINT1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HAI-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPINT1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HAI-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HAI-1 nelle cellule tumorali con espressione di SPINT1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.