GW182 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400906-ACT

Il gene umano TNRC6A codifica GW182, una proteina impalcatura centrale dei GW/P-bodies che collega i microRNA legati ad Argonaute al silenziamento genico post-trascrizionale. GW182 interagisce con i complessi deadenilasici CCR4–NOT e PAN2–PAN3 per promuovere la deadenilazione degli mRNA, il decapping e la degradazione, e contribuisce anche alla repressione traduzionale dei trascritti bersaglio. Attraverso queste attività, TNRC6A contribuisce a modellare programmi di espressione genica coinvolti nel controllo del ciclo cellulare, nella differenziazione e nelle risposte allo stress. La deregolazione del silenziamento mediato da miRNA e della dinamica dei P-bodies è stata associata a segnalazione oncogenica, fenotipi del neurosviluppo e processi legati al sistema immunitario, rendendo TNRC6A un nodo utile per studi meccanicistici della regolazione dell’RNA.

GW182 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TNRC6A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GW182 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TNRC6A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TNRC6A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GW182. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TNRC6A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GW182 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GW182 nelle cellule tumorali con espressione di TNRC6A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.