GTPBP9 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405643-ACT

L’OLA1 umano codifica la proteina Obg-like ATPase 1, nota anche come GTPBP9, una NTPasi di tipo P-loop implicata nella regolazione dell’omeostasi proteica e delle risposte cellulari allo stress. OLA1/GTPBP9 è stata associata alla modulazione di processi legati alla traduzione e al controllo qualità mediato da chaperoni, contribuendo a plasmare la proteostasi in condizioni di stress ossidativo e metabolico. Attraverso queste attività, può influenzare reti di segnalazione che collegano lo stato nutrizionale alla sintesi e al ripiegamento proteico, incluse vie che intersecano le risposte integrate allo stress. Un’espressione deregolata di OLA1/GTPBP9 è stata riportata in molteplici contesti patologici, a supporto della sua utilità come bersaglio di ricerca per lo studio di fenotipi adattativi allo stress, della proliferazione e del mantenimento del proteoma nelle cellule umane.

GTPBP9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OLA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GTPBP9 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OLA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OLA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GTPBP9. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OLA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GTPBP9 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GTPBP9 nelle cellule tumorali con espressione di OLA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.