G_{α q} Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400500-ACT

GNAQ codifica la subunità alfa Gαq delle proteine G eterotrimeriche, un trasduttore chiave dei segnali provenienti da numerosi recettori accoppiati a proteine G (GPCR). In seguito all’attivazione del recettore, Gαq attiva la fosfolipasi C-β generando IP3 e DAG, innescando la mobilizzazione intracellulare di Ca2+ e la segnalazione della protein chinasi C, che modulano secrezione, contrazione, proliferazione e programmi trascrizionali. Questa via si integra con MAPK/ERK e con altri effettori a valle, influenzando le decisioni sullo stato cellulare e la dinamica del citoscheletro. Una segnalazione deregolata di GNAQ è associata a fenotipi oncogenici e vascolari in contesti rilevanti per la malattia, rendendolo un nodo frequentemente studiato nelle reti di segnalazione guidate dai GPCR.

Gα q Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GNAQ senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gα q Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GNAQ nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GNAQ, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gα q. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GNAQ nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gα q nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gα q nelle cellule tumorali con espressione di GNAQ silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.