G_{α i-3} Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400453-ACT

GNAI3 codifica a subunidade humana Gαi-3 das proteínas G heterotriméricas, que acopla muitos GPCRs à inibição da adenilil ciclase, reduzindo o cAMP intracelular e modulando a sinalização a jusante dependente de PKA. Por meio do ciclo GPCR–proteína G, a Gαi-3 influencia a atividade de canais iônicos, a dinâmica da via MAPK e a comunicação cruzada com a sinalização PI3K/AKT, moldando respostas como quimiotaxia, secreção e proliferação. Alterações na expressão de GNAI3 ou a reconfiguração do eixo GPCR–Gi têm sido estudadas em contextos como sinalização imune, função neuronal e redes de sinalização associadas ao câncer, nas quais a homeostase de cAMP e programas de migração estão perturbados.

Gα i-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GNAI3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Gα i-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GNAI3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GNAI3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Gα i-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GNAI3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Gα i-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Gα i-3 em células tumorais com expressão de GNAI3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.