G_{α i-3} Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400453-ACT

GNAI3 codifica la subunità umana Gαi-3 delle proteine G eterotrimeriche, che accoppia molti GPCR all’inibizione dell’adenilato ciclasi, riducendo il cAMP intracellulare e modulando la segnalazione a valle dipendente da PKA. Attraverso il ciclo di attivazione/inattivazione GPCR–proteina G, Gαi-3 influenza l’attività dei canali ionici, la dinamica della via MAPK e il cross-talk con la segnalazione PI3K/AKT, plasmando risposte quali chemiotassi, secrezione e proliferazione. Alterazioni dell’espressione di GNAI3 o una riorganizzazione dell’asse GPCR–Gi sono state studiate in contesti che includono la segnalazione immunitaria, la funzione neuronale e reti di segnalazione associate al cancro, in cui l’omeostasi del cAMP e i programmi di migrazione risultano perturbati.

Gα i-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GNAI3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gα i-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GNAI3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GNAI3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gα i-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GNAI3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gα i-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gα i-3 nelle cellule tumorali con espressione di GNAI3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.