G_{α 11} Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401653-ACT

GNA11 codifica la subunità alfa Gα11 della proteina G eterotrimerica umana, un trasduttore chiave dei segnali provenienti dai GPCR accoppiati a Gq/11 verso le vie effettrici a valle. In seguito all’attivazione recettoriale, Gα11 stimola la fosfolipasi C-β, favorendo la produzione di IP3/DAG, la mobilizzazione del Ca2+ intracellulare e l’attivazione della protein chinasi C, con effetti a valle su MAPK/ERK e su programmi trascrizionali che controllano proliferazione, secrezione e differenziamento. La segnalazione di GNA11 contribuisce alla regolazione del tono vascolare, della funzione endocrina e dell’eccitabilità neuronale, e la deregolazione di questo asse è stata collegata alla segnalazione oncogenica e a un’alterata regolazione dello stato cellulare in molteplici contesti patologici. In quanto nodo prossimale della trasduzione del segnale dei GPCR, Gα11 viene spesso studiata per analizzare il bias di via, le risposte calcio-dipendenti e il cross-talk con la segnalazione dei fattori di crescita.

Gα 11 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GNA11 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gα 11 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GNA11 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GNA11, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gα 11. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GNA11 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gα 11 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gα 11 nelle cellule tumorali con espressione di GNA11 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.