GSK3 beta Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-425249-ACT

Il gene murino **Gsk3b** codifica la glicogeno sintasi chinasi 3 beta (GSK3 beta), una chinasi serina/treonina che integra segnali provenienti dalle vie PI3K–AKT, Wnt/β-catenina, Hedgehog e dai pathway infiammatori, per controllare il turnover proteico dipendente dalla fosforilazione e i programmi trascrizionali. GSK3 beta regola il metabolismo del glicogeno, la progressione del ciclo cellulare, l’apoptosi, la dinamica del citoscheletro e lo sviluppo neuronale attraverso substrati che includono la β-catenina e molteplici fattori di trascrizione. Un’attività deregolata di GSK3 beta è stata associata ad alterazioni della segnalazione insulinica e dell’omeostasi metabolica, a una segnalazione Wnt aberrante e a cambiamenti della plasticità sinaptica e degli stati neuroinfiammatori. Nei modelli murini, la modulazione dell’espressione di **Gsk3b** è comunemente utilizzata per indagare il crosstalk tra pathway che influenza proliferazione, differenziamento e risposte allo stress in diversi tessuti.

GSK3 beta Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Gsk3b senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GSK3 beta Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Gsk3b nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Gsk3b, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GSK3 beta. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Gsk3b nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GSK3 beta nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GSK3 beta nelle cellule tumorali con espressione di Gsk3b silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.