GRP 75 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400471-ACT

HSPA9 codifica GRP75 (mortalin), uno chaperone della famiglia HSP70 associato ai mitocondri che supporta l’importazione e il ripiegamento delle proteine, nonché la proteostasi, all’interno della matrice mitocondriale. GRP75 contribuisce alla bioenergetica mitocondriale, all’assemblaggio dei cluster ferro-zolfo e alla segnalazione adattativa allo stress; inoltre partecipa alla comunicazione tra mitocondri e reticolo endoplasmatico (ER), influenzando la gestione del calcio e l’omeostasi redox. Attraverso queste funzioni, HSPA9 è collegato a vie che regolano il controllo di qualità mitocondriale, la sensibilità all’apoptosi e le risposte cellulari allo stress ossidativo e proteotossico. Un’attività e un’espressione deregolate di GRP75 sono state associate, in sistemi sperimentali, ad alterazioni della funzione mitocondriale e a fenotipi rilevanti per la neurodegenerazione, la disfunzione ematopoietica e la biologia del cancro.

GRP 75 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HSPA9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GRP 75 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HSPA9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HSPA9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GRP 75. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HSPA9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GRP 75 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GRP 75 nelle cellule tumorali con espressione di HSPA9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.