gremlin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423885-ACT

Il gene murino Grem1 codifica gremlin-1, un antagonista secreto della famiglia DAN che si lega a BMP2, BMP4 e BMP7 per modulare la segnalazione della superfamiglia BMP/TGF-β e la trascrizione a valle dipendente da SMAD. Limitando l’attività delle BMP, gremlin-1 influenza la patterning embrionale, le interazioni epitelio–mesenchima e l’omeostasi tissutale, e può modellare il rimodellamento della matrice extracellulare e il crosstalk tra stroma e parenchima. Una regolazione anomala dell’espressione di Grem1 è associata a programmi di sviluppo alterati e a processi legati alla fibrosi, ed è spesso studiata in contesti in cui la segnalazione BMP governa l’impegno di linea e la regolazione del microambiente. Nei modelli murini, Grem1 rappresenta un nodo facilmente manipolabile per analizzare le dinamiche della via BMP durante l’organogenesi e in stati di rimodellamento rilevanti per la malattia.

gremlin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Grem1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

gremlin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Grem1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Grem1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di gremlin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Grem1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da gremlin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via gremlin-1 nelle cellule tumorali con espressione di Grem1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.