GPRC6A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403492-ACT

GPRC6A codifica un recettore accoppiato a proteine G di classe C, implicato nel rilevamento dei nutrienti e nel crosstalk endocrino-metabolico, che risponde a segnali extracellulari quali amminoacidi basici e cationi bivalenti. Attraverso l’accoppiamento a proteine G eterotrimeriche, GPRC6A può modulare la segnalazione dei secondi messaggeri e le vie chinasi a valle che influenzano il metabolismo cellulare, la secrezione ormonale e il tono infiammatorio. La sua attività è stata studiata in contesti che includono l’omeostasi del glucosio, il bilancio energetico e la segnalazione osteoendocrina, collegando la segnalazione dipendente dal recettore alla biologia metabolica e scheletrica. Alterazioni dell’espressione o della segnalazione di GPRC6A sono state associate in letteratura a fenotipi di malattia complessi rilevanti per obesità, diabete di tipo 2 e tratti cardiometabolici, a supporto del suo impiego in studi meccanicistici di pathway.

GPRC6A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPRC6A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPRC6A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPRC6A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPRC6A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPRC6A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPRC6A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPRC6A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPRC6A nelle cellule tumorali con espressione di GPRC6A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.