GPR40 Particelle di Attivazione Lentivirale (h2): sc-401434-LAC-2

FFAR1 umano (GPR40) codifica un recettore accoppiato a proteine G per acidi grassi liberi a catena media e lunga, che si accoppia principalmente a Gαq/11 inducendo l’attivazione della fosfolipasi C, la mobilizzazione del Ca2+ intracellulare e la segnalazione a valle tramite PKC/MAPK. Nelle cellule β pancreatiche e in altri tessuti metabolicamente attivi, GPR40 funge da sensore di nutrienti, collegando la disponibilità di lipidi a risposte secretorie regolate e a un controllo più ampio dell’omeostasi glucosio-lipidi. Un’alterazione della segnalazione di FFAR1 è stata implicata nella disregolazione metabolica, inclusi difetti della secrezione di insulina associati all’obesità e fenotipi rilevanti per il diabete di tipo 2, ed è stata inoltre esplorata in contesti quali l’infiammazione e il metabolismo del cancro. L’editing genetico di FFAR1 consente di dissezionare i meccanismi della segnalazione acidi grassi–GPCR, di interrogare l’accoppiamento stimolo–secrezione delle cellule β e di mappare le vie di segnalazione in modelli cellulari mediante saggi trascrittomici, fosfoproteomici e funzionali.

Le particelle di attivazione lentivirale GPR40 (h2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di FFAR1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale GPR40 (h2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione FFAR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di GPR40. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo FFAR1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.