GPR40 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401434-ACT

FFAR1 (GPR40) umano codifica un recettore accoppiato a proteine G per acidi grassi liberi a catena media e lunga, che si accoppia prevalentemente a Gq/11 per stimolare la segnalazione della fosfolipasi C, la mobilizzazione intracellulare di Ca2+ e l’attività a valle delle vie PKC/MAPK. Nella biologia delle isole pancreatiche, GPR40 collega il sensing dei lipidi nutrienti alla modulazione della secrezione di insulina stimolata dal glucosio e contribuisce anche alla segnalazione responsiva ai lipidi nelle cellule enteroendocrine e in altri tipi cellulari metabolicamente attivi. L’alterata attività di FFAR1/GPR40 è stata studiata nel contesto dello stress metabolico, inclusi obesità e diabete di tipo 2, in cui la segnalazione guidata dagli acidi grassi può influenzare il crosstalk endocrino e infiammatorio. In quanto recettore di membrana che integra segnali lipidici con output trascrizionali e secretori, FFAR1 è spesso utilizzato per analizzare la dinamica della segnalazione dei GPCR, le risposte dei secondi messaggeri e la regolazione delle vie metaboliche.

GPR40 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FFAR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR40 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FFAR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FFAR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR40. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FFAR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR40 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR40 nelle cellule tumorali con espressione di FFAR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.