GPR35 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416792-ACT

GPR35 codifica un recettore accoppiato a proteine G di classe A, arricchito nei tessuti immunitari e gastrointestinali, che si accoppia a proteine G eterotrimeriche per regolare la segnalazione intracellulare dei secondi messaggeri. Tra i ligandi riportati figurano piccole molecole associate al microbioma e al metabolismo, collocando GPR35 come un sensore che collega segnali ambientali a risposte cellulari. Le vie a valle coinvolgono comunemente la modulazione di cAMP, dei flussi di Ca²⁺ e della segnalazione ERK/MAPK, con effetti su chemiotassi, funzione di barriera e produzione di mediatori infiammatori. Alterazioni dell’espressione o della segnalazione di GPR35 sono state associate alla suscettibilità alla malattia infiammatoria intestinale e a fenotipi immunometabolici più ampi, a sostegno della sua rilevanza negli studi sull’immunità mucosale e sull’infiammazione.

GPR35 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR35 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR35 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR35 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR35, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR35. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR35 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR35 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR35 nelle cellule tumorali con espressione di GPR35 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.