GPR34 Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-405989-ACT-2

Il gene umano GPR34 codifica un recettore accoppiato a proteine G di tipo rodopsina, prevalentemente associato alla segnalazione mediata da Gi/o, modulando la dinamica intracellulare del cAMP e le risposte a valle MAPK/ERK in contesti di cellule immunitarie e gliali. La responsività riportata a ligandi derivanti da segnali lisofosfolipidici e mediatori correlati colloca GPR34 all’interno di reti di GPCR sensibili ai lipidi che influenzano la chemiotassi, la segnalazione associata alle citochine e i programmi di attivazione della microglia. Un’alterata espressione di GPR34 e ricorrenti modifiche regolatorie o codificanti sono state associate a disfunzioni della regolazione immunitaria e alla biologia delle neoplasie ematologiche, supportandone l’impiego come strumento molecolare per interrogare stati trascrizionali guidati dai GPCR. L’editing genetico o la perturbazione di GPR34 consente studi meccanicistici sul traffico recettoriale, sul bias di segnalazione dipendente dal ligando e su fenotipi specifici per tipo cellulare in modelli di neuroinfiammazione e di comunicazione nel microambiente tumorale.

GPR34 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR34 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR34 Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR34 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR34, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR34. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR34 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR34 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR34 nelle cellule tumorali con espressione di GPR34 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.