GPR20 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407471-ACT

GPR20 codifica un recettore orfano di classe A accoppiato a proteine G, associato prevalentemente alla biologia neuronale e neuroendocrina, dove si ritiene contribuisca a modulare la segnalazione mediata da recettori che influenza la dinamica dell’AMP ciclico, l’attività delle MAPK e i programmi trascrizionali a valle. In quanto GPCR di membrana, GPR20 può modulare la comunicazione cellula‑cellula e le reti di segnalazione responsiva agli stimoli che coordinano differenziamento, eccitabilità e processi secretori in contesti cellulari pertinenti. Alterazioni della segnalazione dei GPCR sono ampiamente implicate in fenotipi neuropsichiatrici e metabolici, rendendo GPR20 un bersaglio utile per analizzare la connettività delle vie e gli stati regolatori guidati dai recettori. Il GPR20 umano è quindi di interesse per studi meccanicistici della trasduzione del segnale associata ai GPCR e per mappare gli effetti sulle reti geniche in sistemi modello rilevanti per la malattia.

GPR20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR20 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR20 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR20, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR20. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR20 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR20 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR20 nelle cellule tumorali con espressione di GPR20 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.