GPR19 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407000-ACT

GPR19 codifica un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) orfano, espresso in molteplici tessuti, ed è stato associato alla regolazione di reti di segnalazione cellulare che plasmano i programmi trascrizionali, lo stato di differenziamento e la fisiologia di risposta allo stress. In quanto recettore di membrana, GPR19 è in posizione ideale per influenzare vie accoppiate ai GPCR come la segnalazione cAMP/PKA e MAPK, con effetti a valle sull’espressione genica e sull’omeostasi cellulare. Un’alterata segnalazione dei GPCR è ampiamente rilevante per la regolazione metabolica, la neurobiologia e la modulazione immunitaria, e le variazioni di espressione di GPR19 sono state indagate in contesti che includono l’infiammazione e fenotipi associati al cancro. La modulazione dei livelli endogeni di GPR19 supporta studi meccanicistici delle dinamiche di segnalazione guidate dal recettore e del cross-talk tra vie in modelli cellulari umani.

GPR19 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR19 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR19 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR19 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR19, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR19. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR19 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR19 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR19 nelle cellule tumorali con espressione di GPR19 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.