GPR174 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-413678-ACT

GPR174 (noto anche come recettore della lisofosfatidilserina) è un recettore accoppiato a proteine G arricchito nelle cellule immunitarie ed è implicato nella regolazione dell’attivazione dei linfociti, della produzione di citochine e dell’omeostasi immunitaria. In seguito al legame con il ligando, può accoppiarsi a una segnalazione dipendente da Gαs, influenzando la produzione di cAMP e i programmi trascrizionali a valle che determinano gli stati funzionali delle cellule T e B. L’attività di GPR174 interseca vie più ampie controllate dai GPCR che regolano la migrazione, le soglie di attivazione e le reti di segnalazione infiammatoria. Un’espressione o una segnalazione deregolate di GPR174 sono state associate alla biologia delle malattie immunomediate e offrono un punto d’ingresso meccanicistico per studiare l’immunoregolazione in modelli cellulari umani.

GPR174 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR174 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR174 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR174 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR174, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR174. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR174 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR174 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR174 nelle cellule tumorali con espressione di GPR174 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.