GPR119 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403135-ACT

GPR119 codifica un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) di classe A, arricchito nelle cellule delle isole pancreatiche e nelle popolazioni enteroendocrine intestinali, dove funziona come recettore sensibile ai lipidi per derivati endogeni degli acidi grassi. Dopo l’attivazione, GPR119 si accoppia principalmente a Gs aumentando il cAMP intracellulare, attivando vie di segnalazione collegate a PKA ed EPAC che modulano l’accoppiamento stimolo–secrezione e le risposte metaboliche cellulari. Questo recettore è studiato nel contesto della segnalazione indotta dai nutrienti, della comunicazione endocrina correlata alle incretine e di programmi trascrizionali dipendenti dal cAMP. La deregolazione della segnalazione dei GPCR e del cAMP che coinvolge GPR119 è stata esplorata nella biologia delle malattie metaboliche, includendo vie rilevanti per l’omeostasi del glucosio e il bilancio energetico.

GPR119 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR119 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR119 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR119 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR119, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR119. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR119 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR119 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR119 nelle cellule tumorali con espressione di GPR119 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.