GPR107 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412891-ACT

GPR107 (recettore accoppiato a proteine G 107) è una proteina di membrana conservata, multipasso, che si localizza prevalentemente nella rete trans-Golgi ed è implicata nel traffico di membrane intracellulari e nello smistamento delle proteine. È stata associata alla regolazione della dinamica della via secretoria e dei processi di trasporto retrogrado che influenzano il riciclo di recettori e carichi tra compartimenti endosomiali e del Golgi. Attraverso questi ruoli, GPR107 può modulare risposte cellulari dipendenti dal trasporto mediato da vescicole, inclusi la gestione dei nutrienti e la disponibilità dei recettori di superficie. Alterazioni dell’espressione di GPR107 sono state riportate in molteplici dataset trascrittomici legati al cancro, a supporto del suo impiego come bersaglio meccanicistico per studiare fenotipi dipendenti dal traffico in modelli rilevanti per la malattia.

GPR107 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR107 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR107 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR107 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR107, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR107. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR107 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR107 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR107 nelle cellule tumorali con espressione di GPR107 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.