GPR105 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405954-ACT

P2RY14 codifica il recettore purinergico umano GPR105, un GPCR che risponde agli UDP-zuccheri extracellulari, come l’UDP-glucosio, e si accoppia alla segnalazione Gi/o per modulare il cAMP intracellulare e i programmi infiammatori a valle. L’attività di GPR105 influenza la chemiotassi dei leucociti e la produzione di citochine, collegando il rilevamento dei nucleotidi-zucchero alla regolazione dell’immunità innata nei compartimenti mieloidi ed epiteliali. Questo recettore interseca le reti di segnalazione delle chemochine e purinergiche che modellano l’infiammazione tissutale e le risposte di barriera. Alterazioni della segnalazione P2RY14/GPR105 sono state associate a disregolazione immunitaria e a fisiopatologia correlata all’infiammazione, rendendolo rilevante per studi meccanicistici dei processi patologici guidati dal microambiente.

GPR105 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di P2RY14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR105 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus P2RY14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione P2RY14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR105. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus P2RY14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR105 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR105 nelle cellule tumorali con espressione di P2RY14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.