gp91phox Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419890-ACT

Cybb codifica gp91phox (NOX2), la subunità catalitica di membrana del complesso NADPH ossidasi dei fagociti che guida la generazione di specie reattive dell’ossigeno durante il burst respiratorio. Nelle cellule dell’immunità innata del topo, gp91phox si associa a p22phox e a regolatori citosolici come p47phox, p67phox e Rac per assemblare un sistema di trasporto di elettroni che riduce l’ossigeno a superossido, favorendo l’uccisione dei microrganismi e la segnalazione dipendente dal redox. Questa attività influenza le vie infiammatorie, la funzione del fagolisosoma e le risposte allo stress ossidativo. L’alterazione o la disregolazione di Cybb/NOX2 è ampiamente studiata in modelli di immunodeficienza, infiammazione cronica e danno tissutale legato al redox.

gp91phox Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cybb senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

gp91phox Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cybb nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cybb, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di gp91phox. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cybb nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da gp91phox nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via gp91phox nelle cellule tumorali con espressione di Cybb silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.