GODZ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403970-ACT

ZDHHC3, noto anche come GODZ, codifica una palmitoil aciltransferasi della famiglia DHHC che catalizza la S-palmitoilazione di residui di cisteina citosolici su proteine bersaglio, regolando la loro associazione alla membrana, il traffico intracellulare, la stabilità e l’output di segnalazione. Questa modifica lipidica influenza il trasporto vescicolare e la compartimentalizzazione di recettori e canali, plasmando così le reti di segnalazione sinaptiche e prossimali alla membrana. Attraverso il suo ruolo nella modifica post-traduzionale e nella proteostasi, ZDHHC3 è stato collegato ad alterazioni della comunicazione cellulare e delle risposte allo stress, spesso studiate nella biologia del cancro e delle malattie neurologiche. Di conseguenza, ZDHHC3 è comunemente analizzato per comprendere come il rimodellamento dei microdomini di membrana dipendente dalla palmitoilazione influenzi l’attivazione delle vie di segnalazione e i fenotipi cellulari.

GODZ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZDHHC3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GODZ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZDHHC3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZDHHC3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GODZ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZDHHC3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GODZ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GODZ nelle cellule tumorali con espressione di ZDHHC3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.