GnRH I Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420625-ACT

Il gene murino **Gnrh1** codifica l’ormone di rilascio delle gonadotropine I (GnRH I), un neuropeptide ipotalamico che coordina la funzione endocrina riproduttiva stimolando le cellule gonadotrope dell’ipofisi a secernere l’ormone luteinizzante e l’ormone follicolo-stimolante. La segnalazione pulsatile di GnRH I attiva vie Gq/11 dipendenti dal recettore del GnRH, inducendo l’attivazione di PLCβ, la mobilizzazione del Ca2+ intracellulare, le cascate PKC/MAPK e programmi trascrizionali che regolano la sintesi e il rilascio delle gonadotropine. Integrandosi con kisspeptina, feedback degli steroidi sessuali e input circadiani/metabolici, **Gnrh1** contribuisce alla tempistica della pubertà, alla fertilità e alla fisiologia riproduttiva ciclica. La disregolazione della produzione o della segnalazione di GnRH I è rilevante in modelli sperimentali di ipogonadismo ipogonadotropo, disturbi puberali e alterazioni neuroendocrine che influenzano l’omeostasi dell’asse riproduttivo.

GnRH I Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Gnrh1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GnRH I Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Gnrh1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Gnrh1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GnRH I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Gnrh1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GnRH I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GnRH I nelle cellule tumorali con espressione di Gnrh1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.