GlyT2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403077-ACT

O SLC6A5 humano codifica o transportador de glicina 2 (GlyT2), um transportador pré-sináptico dependente de Na⁺/Cl⁻ que medeia a recaptação de glicina de alta afinidade para neurónios glicinérgicos inibitórios. Ao manter o fornecimento vesicular de glicina e ao moldar a disponibilidade sináptica de glicina, o GlyT2 é central para a reciclagem de neurotransmissores, para os circuitos inibitórios da medula espinal e do tronco encefálico e para a regulação global do processamento motor e sensorial. A função do SLC6A5 articula-se com o transporte por transportadores da família solute carrier, o transporte transmembranar acoplado a iões e vias de transmissão sináptica que influenciam a excitabilidade neuronal. Alterações na atividade ou na expressão do GlyT2 estão associadas a uma neurotransmissão inibitória desregulada e são relevantes para a investigação de fenótipos hereditários de sobressalto e de outras perturbações do controlo motor.

GlyT2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC6A5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GlyT2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC6A5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC6A5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GlyT2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC6A5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GlyT2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GlyT2 em células tumorais com expressão de SLC6A5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.