glypican-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400256-ACT

GPC3 codifica la glicpican-3, un proteoglicano eparan-solfato ancorato al glicosilfosfatidilinositolo (GPI), localizzato sulla superficie cellulare e all’interfaccia con la matrice extracellulare. La glicpican-3 modula la disponibilità e il raggio d’azione del segnale di morfogeni e fattori di crescita, influenzando vie tra cui Wnt/β-catenina, Hedgehog, FGF e BMP, per regolare proliferazione cellulare, adesione e patterning dello sviluppo. Un’espressione alterata di GPC3 è associata a una crescita tissutale disregolata e a programmi di segnalazione oncogenici, ed è ampiamente studiata come regolatore dipendente dal contesto nella biologia del fegato e negli stati cellulari associati ai tumori. Queste proprietà rendono GPC3 un utile punto di partenza per analizzare la segnalazione dipendente dall’eparan solfato, le interazioni recettore–ligando e la regolazione microambientale dei gradienti di fattori di crescita.

glypican-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPC3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

glypican-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPC3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPC3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di glypican-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPC3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da glypican-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via glypican-3 nelle cellule tumorali con espressione di GPC3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.