Glutathione Peroxidase 8/GPX8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404847-ACT

La GPX8 (Glutathione Peroxidase 8) umana è una glutatione perossidasi associata al reticolo endoplasmatico che contribuisce all’omeostasi redox riducendo i perossidi e limitando il danno ossidativo alle proteine all’interno della via secretoria. Modellando le condizioni di ripiegamento ossidativo nel RE e il flusso di perossidi, GPX8 influenza la proteostasi, la segnalazione della risposta alle proteine mal ripiegate (UPR) e, più in generale, le vie cellulari legate allo stress ossidativo. Un’alterazione dell’espressione o dell’attività di GPX8 è stata collegata in letteratura a uno squilibrio del bilanciamento redox e a una segnalazione infiammatoria disregolata, con una rilevanza riportata in diversi contesti, come la biologia tumorale e lo stress metabolico. Di conseguenza, GPX8 è spesso studiata per il suo ruolo nella segnalazione dipendente dalle ROS, nell’adattamento allo stress del RE e nelle transizioni di stato cellulare controllate dal redox.

Glutathione Peroxidase 8/GPX8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPX8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Glutathione Peroxidase 8/GPX8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPX8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPX8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Glutathione Peroxidase 8/GPX8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPX8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Glutathione Peroxidase 8/GPX8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Glutathione Peroxidase 8/GPX8 nelle cellule tumorali con espressione di GPX8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.