GluR-δ2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403400-ACT

GRID2 codifica il recettore ionotropico del glutammato delta-2 (GluR-δ2), una proteina di tipo recettoriale arricchita nel cervelletto ed essenziale per l’organizzazione delle sinapsi eccitatorie e per la plasticità sinaptica. Più che funzionare come un canale convenzionale attivato da ligando, GluR-δ2 agisce come organizzatore sinaptico nelle sinapsi tra fibre parallele e cellule di Purkinje, coordinando complessi di segnalazione recettoriale e rimodellamento dipendente dall’attività. Contribuisce a processi quali la depressione a lungo termine, la maturazione delle spine dendritiche e lo sviluppo dei circuiti cerebellari attraverso reti di segnalazione glutammatergica. La deregolazione di GRID2 è stata associata a fenotipi di tipo neuroevolutivo e neurodegenerativo caratterizzati da disfunzione cerebellare, incluse vie correlate all’atassia.

GluR-δ2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GRID2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GluR-δ2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GRID2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GRID2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GluR-δ2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GRID2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GluR-δ2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GluR-δ2 nelle cellule tumorali con espressione di GRID2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.