GLI-1/GLI1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400266-ACT

GLI1 codifica un fattore di trascrizione a dita di zinco che funge da effettore terminale centrale della segnalazione Hedgehog, integrando segnali a monte provenienti da PTCH1 e SMO per regolare programmi genici che controllano proliferazione, differenziamento e patterning tissutale. Nel nucleo, GLI-1 si lega agli elementi consenso GLI per modulare l’espressione di bersagli coinvolti nella progressione del ciclo cellulare, negli stati simili alle staminali e nella transizione epitelio–mesenchimale. Il crosstalk con vie come TGF-β, MAPK e PI3K/AKT può modulare l’output trascrizionale di GLI1 e i fenotipi specifici del contesto. Un’attività deregolata di GLI1 è spesso utilizzata come indicatore molecolare di un’alterata segnalazione della via Hedgehog nei tumori e in altri disturbi dello sviluppo.

GLI-1/GLI1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GLI1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GLI-1/GLI1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GLI1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GLI1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GLI-1/GLI1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GLI1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GLI-1/GLI1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GLI-1/GLI1 nelle cellule tumorali con espressione di GLI1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.