GlcAT-S Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408633-ACT

B3GAT2 codifica la glucuroniltransferasi S (GlcAT-S), una glicosiltransferasi localizzata nel Golgi che trasferisce acido glucuronico durante la biosintesi della regione di collegamento glicosaminoglicano–proteina necessaria per l’assemblaggio dei proteoglicani. Attraverso il suo ruolo nella glicosilazione e nell’organizzazione della matrice extracellulare, GlcAT-S influenza le interazioni cellula–matrice, la segnalazione mediata dai recettori e i processi di sviluppo che dipendono da proteoglicani correttamente modificati. L’alterazione della biosintesi dei proteoglicani e della formazione della regione di collegamento è associata a cambiamenti nell’architettura dei tessuti e ad anomalie di segnalazione rilevanti per la ricerca sul tessuto connettivo e sulla neurobiologia. In quanto glicoenzima umano, GlcAT-S è inoltre di interesse per studiare come gli stati di glicosilazione del Golgi modellino la composizione della superficie cellulare e l’attività delle vie a valle.

GlcAT-S Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di B3GAT2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GlcAT-S Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus B3GAT2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione B3GAT2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GlcAT-S. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus B3GAT2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GlcAT-S nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GlcAT-S nelle cellule tumorali con espressione di B3GAT2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.