GFRP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405353-ACT

Il gene umano **GCHFR** codifica la **proteina regolatrice del feedback della GTP cicloidrolasi I** (GFRP), un modulatore allosterico chiave della **GTP cicloidrolasi I** (GCH1) che regola finemente la biosintesi *de novo* della **tetraidrobiopterina** (BH4). Integrando i segnali provenienti da BH4 e dalla fenilalanina, GFRP contribuisce a mantenere l’omeostasi del cofattore, supportando l’idrossilazione degli amminoacidi aromatici e l’attività delle ossido nitrico sintasi, con effetti sulla produzione di neurotrasmettitori e sulla segnalazione sensibile allo stato redox. Questa regolazione collega GCHFR al controllo metabolico dei processi vascolari e immunitari dipendenti dall’NO e alle vie biosintetiche delle monoamine nel sistema nervoso. Una disponibilità di BH4 deregolata e un controllo alterato dell’asse GCH1–GFRP sono stati associati a fenotipi rilevanti per la segnalazione del dolore, la disfunzione endoteliale e lo squilibrio dei neurotrasmettitori, rendendo **GCHFR** un nodo utile per studi mirati alle vie di segnalazione.

GFRP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GCHFR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GFRP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GCHFR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GCHFR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GFRP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GCHFR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GFRP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GFRP nelle cellule tumorali con espressione di GCHFR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.