GFRα-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405061-ACT

GFRA3 codifica il recettore umano GFRα-3 ancorato alla membrana tramite glicosilfosfatidilinositolo (GPI), un co-recettore che lega membri della famiglia di ligandi del fattore neurotrofico derivato dalla linea delle cellule gliali (GDNF) e convoglia la segnalazione verso la tirosin-chinasi recettoriale RET. Attraverso l’attivazione RET-dipendente di MAPK/ERK, PI3K/AKT e di vie correlate di sopravvivenza e differenziamento, GFRα-3 contribuisce allo sviluppo neuronale, alla guida assonale e al mantenimento dei neuroni sensitivi periferici e dei neuroni del sistema nervoso autonomo. L’espressione e la segnalazione di GFRA3 sono state studiate in contesti di regolazione neuro-sviluppativa, biologia dei neuroni sensitivi legata al dolore e modulazione di vie oncogeniche in specifici modelli tumorali in cui è implicata l’attività dell’asse RET. In quanto componente recettoriale di superficie cellulare, è inoltre utile per studiare la specificità ligando–recettore, l’assemblaggio dei complessi recettoriali e le risposte trascrizionali a valle.

GFRα-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GFRA3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GFRα-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GFRA3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GFRA3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GFRα-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GFRA3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GFRα-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GFRα-3 nelle cellule tumorali con espressione di GFRA3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.