GCSH Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-406784-ACT-2

Il gene umano GCSH codifica la proteina H del sistema di scissione della glicina, una subunità mitocondriale trasportatrice di lipoile che trasferisce intermedi tra i componenti P, T e L del complesso della glicina decarbossilasi, sostenendo il catabolismo della glicina e il trasferimento di unità monocarboniose. Grazie alla sua attività dipendente dalla lipoilazione, GCSH contribuisce al metabolismo mitocondriale dei folati mediato dalle unità a un carbonio, con effetti sulla biosintesi dei nucleotidi, sull’equilibrio redox e sull’accoppiamento metabolico con l’interconversione serina–glicina. L’alterazione genetica di GCSH o una lipoilazione compromessa sono collegate a difetti della via di scissione della glicina e sono state associate a errori congeniti del metabolismo come l’iperglicinemia non chetotica. L’editing genomico di GCSH consente studi meccanicistici del metabolismo mitocondriale degli amminoacidi, della lipoilazione proteica e del flusso a un carbonio, inclusa la generazione di modelli cellulari per analizzare le risposte allo stress metabolico e la funzione delle varianti.

GCSH Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GCSH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GCSH Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GCSH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GCSH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GCSH. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GCSH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GCSH nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GCSH nelle cellule tumorali con espressione di GCSH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.