GalNAc-T3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407682-ACT

GALNT3 codifica la polipeptide N-acetilgalattosaminiltransferasi 3 (GalNAc-T3), un enzima iniziatore residente nel Golgi per la glicosilazione O‑legata di tipo mucinico, che trasferisce GalNAc su residui di serina/treonina di proteine secretorie e di membrana. Definendo i siti di inizio delle O‑glicani, GalNAc‑T3 influenza il ripiegamento proteico, il traffico intracellulare, la suscettibilità alle proteasi e la funzione di recettori e molecole di adesione lungo vie epiteliali e secretorie. Un’alterata attività di GALNT3 è stata associata a una deregolazione dell’elaborazione delle glicoproteine e della segnalazione extracellulare, con rilevanza per i disturbi dell’omeostasi del fosfato e per fenotipi più ampi legati alla glicosilazione. La modulazione di GalNAc‑T3 è quindi utile per chiarire come la O‑glicosilazione controlli le interazioni cellula‑cellula, i programmi secretori e la comunicazione ligando‑recettore.

GalNAc-T3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GALNT3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GalNAc-T3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GALNT3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GALNT3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GalNAc-T3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GALNT3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GalNAc-T3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GalNAc-T3 nelle cellule tumorali con espressione di GALNT3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.